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      穩定轉染細胞株的構建原理-----@古朵新聞

      發布時間:2020-04-28瀏覽次數:39返回列表


      構建穩定細胞系的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉染到宿主細胞并整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標志進行篩選,zui常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418來代替新霉素進行選擇性篩選,篩選得到可穩定表達目的蛋白,或者穩定表達沉默特定基因的細胞株。


      1. 2 穩定轉染細胞株的構建
      原理:
      穩定轉染,就是轉染的質粒DNA整合到宿主細胞染色體上,使宿主細胞可
      長期表達目的基因及蛋白。需要在瞬時轉染基礎上對靶細胞進行篩選或者應用高轉染效率的病毒,根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物進行細胞傳代,從而得到可穩定表達目的基因的細胞系。
      應用:
      觀察目的基因及其表達蛋白在某種細胞中的功能(穩定,可長期進行研究)
      一般流程:
      1)   篩選濃度測定:以10~14天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度
      2)   細胞接種:轉染實驗前天接種細胞,各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞密度應達到60%~80%覆蓋
      3)   細胞轉染(病毒、脂質體、電穿孔、FuGENE 6)
      4)   利用質粒上含有的抗性選擇進行篩選
      5)   鑒定篩選結果
      前期需要準備:
      構建好的外源基因載體
      待轉染的細胞系(1×106個細胞,可傳代,倍增時間小于48小時)以及細胞培養條件的說明
      若需要檢測靶基因的表達變化,請提供相應

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