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      細胞集落形成實驗-----古朵實驗

      發布時間:2020-04-28瀏覽次數:36返回列表

      非整倍體無限細胞系和癌細胞株中,仍然存在不同細胞亞群,它們的功能和生長特點有些差異,其中有些亞群細胞對培養環境有較大的適應性和具有較強的獨li生存能力,細胞集落率高。純化細胞群來自一個共同的祖細胞,細胞遺傳性狀、生物學特性相似,利于實驗研究。原代培養細胞和二倍體有限細胞系,細胞集落率很低。細胞集落化培養之前,應先測定細胞集落形成率,以了解細胞在極低密度條件下的生長能力。

      目前認為僅有腫瘤干細胞具有形成集落的能力,集落抑制率常用于抗癌藥物敏感試驗、腫瘤放射生物學試驗。

      集落抑制率=(1-(實驗組集落形成率/對照組集落形成率))×



      (一)原理

      細胞集落形成率 單個細胞在體外增殖6代以上,其后代所組成的細胞群體,稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細胞,大小在0.3-1.0mm 之間。集落形成率表示細胞獨li生存能力。常用方法有平板集落形成試驗、軟瓊脂集落形成試驗。

      (二)實驗用品

      1.材料:Hela細胞。

      2.器材:(直徑 60mm )培養皿、細胞記數板、燒杯、吸管、離心機、離心管、廢液瓶、倒置顯微鏡、二氧化碳培養箱、超凈工作臺、水浴鍋。

      3.試劑:Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清細胞培養液、安爾dian、瓊脂。

      (三)方法

      1.平板克隆形成試驗

      本法適用于貼壁生長的細胞,包括培養的正常細胞和腫瘤細胞。

      (1)對指數生長期細胞,采用常規消化傳代方法,制成細胞懸液。

      (2)細胞懸液反復吹打,使細胞充分分散,單個細胞百分率應在95%以上。細胞記數,并用培養基調節細胞濃度,待用。

      (3)根據細胞增殖能力,將細胞懸液倍比稀釋。一般按照每皿含50、100、200個細胞的濃度分別接種5ml細胞懸液到培養皿(直徑 60mm )中,以十字方向輕輕晃動培養皿,使細胞分散均勻。

      (4)培養皿置 37℃ 、5%CO2中培養2~3周,中間根據培養液pH變化適時geng換新鮮培養液。

      (5)當培養皿中出現肉眼可見克隆時,終止培養,棄去培養液,PBS液小心浸洗2次,空氣干燥。甲醇固定15分鐘,棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10分鐘,流水緩慢洗去染液,空氣干燥。

      2.軟瓊脂集落形成試驗

      本法適用于非錨著依賴性生長的細胞,如骨髓造血干細胞、腫瘤細胞株、轉化細胞系。利用瓊脂液無粘著性又可凝固的特性,將腫瘤細胞混入瓊脂液中,瓊脂液凝固使腫瘤細胞置于一定位置,瓊脂中腫瘤細胞可能向周圍作quan方位的移動,因此可以用來檢測腫瘤細胞的主動移動能力。腫瘤細胞在適宜培養基中又可以增殖,從而可以測定腫瘤細胞克隆形成率。造血系統軟瓊脂集落形成試驗方法相同,主要用于有關細胞分化的研究,但使用培養基不同。

      (1)同上(1)~(3)步驟。

      (2)調整細胞懸液密度為1×103個/ml細胞。

      (3)制備底層瓊脂,完全溶化的5%瓊脂和 37℃ 左右預溫的新鮮完全培養液以1:9比例在 40℃ 均勻混合,加入培養皿(直徑 60mm )中,每皿含0.5%瓊脂培養基2ml,室溫下瓊脂完全凝固。

      (4)制備上層瓊脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200個)的細胞懸液1.5ml移入小燒杯中,加入 40℃ 、5%瓊脂等體積混勻,即成0.25%半固體瓊脂培養基。配好的半固體瓊脂培養基立即加入鋪有底層瓊脂的培養皿中,室溫下瓊脂凝固。 37℃ 、5%CO2靜置培養2-3周。

      (四)實驗結果

      1.定期觀察細胞培養過程中集落的形成。

      2.顯微鏡下計數大于50個細胞克隆數,然后按下式計算集落形成率:

      集落形成率(%)=(集落數/接種細胞數)×100

      (五)注意事項

      1.瓊脂對熱和酸不穩定,如果反復加熱,容易降解,產生毒性,同時瓊脂硬度下降。故瓊脂高壓滅菌( 10磅 15分鐘)后按一次用量進行分裝。

      2.細胞懸液中,細胞分散度>95%。

      3.軟瓊脂培養時,注意瓊脂與細胞混合時溫度不要超過 40℃ ,以免燙傷細胞。

      4.接種細胞密度不宜過高。

      5.細胞在低密度條件下培養,生存率明顯下降,無限細胞系和腫瘤細胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培養細胞和有限細胞系僅為0.5~5%,甚至為零。為提高集落形成率,必要時在培養基中添加胰島素、地塞米松等促細胞克隆形成物質。

      (六)復習思考題

      比較平板克隆形成試驗和軟瓊脂集落形成試驗的異

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